实验方法学噬菌体展示耐药突变HIV1蛋白酶敏感切割位点六肽随机文库的构建卢海妹1周波\潘卫2贾建安2王锦红2温宗梅\何俊1陈露\邓松华1（1.安徽医科大学病理生理学教研室，合肥2300322第二军医大学基础医学部微生物学教研室，上海中国图书分类号：R341.感切割位点序列体外噬菌体筛选模型，研宄HV1蛋白酶耐药性突变与敏感切割序列的关系。方法用含随机核苷酸序列的引物PCR方法对HV1gag基因上的CAP2片段的PR切割位点处的氨基酸序列进行随机化，再将重组CAP2片段和NC片段拼接克隆于噬菌体展示载体LD3pCANTAB5S上，建立HIV1蛋白酶靶蛋白切割位点随机化的噬菌体展示文库。结果该噬菌体展示文库库谷量为26X106，滴度为4.1父101510-：1，人，2片段插入率为47.8%；序列分析显示切割位点中随机化的核苷酸与氨基酸均呈随机性分布。结论成功地构建HV1蛋白酶的敏感切割序列噬菌体筛选文库，为筛选到突变PR敏感切割序列噬菌体及研宄耐药HV1蛋白酶抑制剂与突变PR的关系打下基础。
示文库1的一项重要措施是高效抗逆转录病毒治疗（highlyactivearitetioviraltherapyHAART）主要是通过联合应用HIV蛋白酶抑制剂（proteaseinhibitor）和逆转录酶抑制剂（reversetranscriptasehbitor）起到抑制HV恢复人体细胞免疫功能的作用HV蛋白酶抑制剂（proteaseinhibibrPI）耐药是直接影响高效抗逆转录病毒疗法（highlyactiveantiretroviraliherapyHAART）治疗效果的一个重要因素，美国一项大规模流行病学调查显示，经过2~3年的人，因此这些病人即使还没开始用药，就己具有耐药性。HV蛋白酶药物作用靶位发生基因突变导致耐药病毒株的基金项目：国家自然科学基金资助项目（No30472050）；安徽省自然科学基金资助项目（No050430706）EmaUhaineiUsinacom邓松华（1954-）男，教授，硕士生导师。研究方向：病理生理学与分子生物学，通讯作者，TeJ产生，蛋白酶底物结合区的突变可使病毒对PI耐受性增加数十倍14，如HIVPR82位点突变，耐受性增加30倍；如果82位和84位残基同时突变则药物疗效下降100倍。由于病毒为了补偿PR的突变对其切割功能的影响，在PR切割位点的氨基酸发生相应的基因突变，因此要对这些突变的PR开发有效的PI必须首先获得它们作用底物的敏感切割序列，在这些序列基础上研制与蛋白酶有更高特异性结合的PI本研宄中我们用PCR方法对蛋白酶底物突变发生频率*多位置p2NC切割位点1）易突变的序列，该载体带Ig：；结合分子LD3可用作固相化标记，将噬菌体文库固定于包被人Ig；》的酶标板上，以便应用PR对该文库进行切割筛选。pCAP2TpNCT质粒分别为编码HV1HXB2株衣壳蛋白（CA）与P2蛋白的融合蛋白（CAP2）核苷酸序列（GenBankNO：AF033819）克隆于T载体的重组质粒，上述质粒与大肠杆菌1》1丁（设10为第二军医大学微生物教研室构建和保存。
12试剂DNATaq酶、PCR溶液DNA回收试剂盒，购自上海申能博彩科技公司，T4DNA连接酶（ligationhighkit）购自TOYOBO公司，限制性内切酶Sul和Sall均为TaKaRa公司产品，质粒DNA提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物公司。
13引物对HIV1CAP2基因片段进行PCR扩增及对P2NCPR切割位点随机化的引物见Tab片段的下游引物C2Bd10引入随机核苷酸编码序列对PR切割序列SATMMPRGN中的易发生突变的ATMMP序列进行随机化，上游引物CIBustu引入Stul、Xbal酶切位点。用于扩增CAP2片段的下游引物C2Bdex引入Sail酶切位点，用于测序的下游引物pCANTAB5S6为5l（；TAAATGAATTTTCTGTATGAGG 31上述引物委托上海生工生物技术有限公司合成。
4重组基因CAP2PCR的扩增制备以pCAP2T质粒为模板分别用引物ClBusU和C2Bd10扩增CAP2片段；取上述CAP2扩增产物1P1为模板用引物ClBusU和C2Bd ex扩增重组的CAP2片段，PCR扩增条件为94°C40s56°C40s72°C60s30个循环。PCR产物于12gL-1琼脂糖凝胶电泳分析，试剂盒溶液回收。回收产物Std和Sal双酶切过夜，DNA凝胶试剂盒胶回收。
5噬菌体展示P2/NCPR切割位点序列随机突变文库的构建LD3pCANTAB5S质粒Sul和Sall双酶切过夜，酶切产物试剂盒溶液回收。取回收的LD3pCANTAB5S载体与纯化的CAP2酶切产物按1：2摩尔比用T4DNA连接酶16C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌TOP10F感受态细胞，取10、10.1l转化液涂LB平板（含氨苄青霉素100mgL-1四环素100mg.L-1），计转化数以计算库容。其余转化液37C 250rmin-1振荡培养过夜，抽提库质粒。
16文库所展示插入片段的鉴定为了证实文库所展示插入片段是CAP2NC我们分别采用PCR和酶切的方法进行鉴定。首先随机挑取突变文库结合平板上23个单克隆，用插入片段上游引物C1Busu和克隆位点下游引物pCANT AB5S6进行PCR扩增，扩增条件为94°C40s55C40s72°C80sTaq酶0.3Pl50Pl反应体积，30个循环。其次挑取PCR鉴定阳性的单克隆加LB（含氨苄青霉素100mgL-1，四环素100mg'L-1）培养基，37C250rmil-1振荡培养过夜，抽提单克隆噬菌粒CAP2LD3pCANTAB5SSul和Sal双酶切，37°C6h酶切产物于10gL-1琼脂糖凝胶电泳分析。
7PR切割位点序列随机突变的重组子序列分析根据PCR检测结果，随机挑取10个阳性克隆，委托由上海英骏生物公司分别以上游C1BuK-su及下游pCANTAB5S6测序引物进行双向测序，测序结果用DNAStar软件分析，比对P2/NCPR切割位点SATMMPRGN中的ATMMP易突变的核苷酸序列是否呈随机性分布。
18随机突变文库的噬菌体展示及滴度测定将重组噬菌粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞，转化产物活化培养1h后，取10、1 0.11转化液涂LB平板（含氨苄青霉素100mg L-1辅助噬菌体M13K07拯救，37°C 250rmin―振荡培养1 111000父，离心10爪1细菌沉淀用10爪12父丫丁（含氨苄青卡那霉素50mg'L-1）悬浮，37°C250rmill-1振荡培养过夜，培养物1 000Xg离心10min上清经0.22m滤膜过滤，获得原代噬菌体展示文库。取11原代噬菌体展示文库10倍系列稀释，各取101的不同稀释度的重组噬菌体感染1001对数生长期的TG137C振荡培养1h涂LB平板（含氨苄青霉素100mgL-1），计数不同稀释度菌落数。*少生长菌落数的稀释倍数乘以100即为噬菌体每毫升的转化单位数（transfoinatiouitTU）。无菌试验：取10P1滤液涂LB平板（含氨苄青霉素100mgL-1），37C孵箱培养过夜，菌落计数。
2结果21重组基因CAP2PCR扩增制备以pCAP2T质粒为模板，用C1BusluC2Bdex引物扩增含随机化PR切割位点序列和Std.Sa1l酶切位点的CA-P2片段，得到长度为761 bp的扩增产物大小与理论值一致（Fig 22噬菌体展示P2/NCPR切割位点序列随机突变文库的构建将CAP2扩增产物用Sul和Sa1l双酶切，再克隆到pCANTAB5SLD3噬菌粒载体的Stul和Sa1l位点中，连接物转化大肠杆菌TOP10F丨取10、10.1P1转化液涂LB平板，长出的菌落分别为大于500个。210个。24个，按1P量计算，该文库的库容为2.6X106个不同的克隆。
23文库所展示插入片段的鉴定随机挑取突变文库结合平板上23个克隆，用引物C1BuK-stu和pCANTAB5S6PCR扩增鉴定阳性插入，其中阳性克隆11个，阳性插入率为47.8%，产物大小750bp左右与理论值一致（Fig3）。为了进一步证实PCR鉴定阳性的克隆确实是由CAP2片段和载体连接而成，我们提取阳性单克隆噬菌粒CAP2LD3pCANTAB5S进行Sul和Sal酶切分析，切出约750bp的DNA片段与CAP2理论值一致（Fig4）感染实验检测该文24PR切割位点序列随机突变的重组子序列分析根据PCR检测结果，随机挑取10个阳性克隆进行序列分析，结果显示：随机化的P2NCPR切割位点SATMMPRGN中的ATMMP易突变的核苷酸序列呈随机性分布（Tab 2），其它序列与原始序列一致。
3讨论HIVPR属于天冬氨酰基蛋白酶，它具有AspThrGly三联体氨基酸序列，其活性形式是由两条含99个氨基酸的多肽链形成的C2对称的同质二聚体，二聚体的每一个亚基天冬氨残基构成酶的活性中心。临床上主要应用的拟肽类的蛋白酶抑制剂是以基于PR前体蛋白切割位点突变的拟肽蛋白酶活性，感染HV病毒的CD4细胞核中的病毒DNA不能聚集和释放，从而使HV病毒失去感染能力，能迅速降低血浆中的HV达到治疗AIDS的作用1911.HIVPI的应用使得耐药突变株的不断产生，因此有必要针对耐药突变株HV开发新的，传统的PI筛选方法很难适用于HV变异株的PI药物开发11213.本研宄将HV1蛋白酶靶蛋白切割位点突变发生频率*多位置p2NC的易突变的序列进行针对性随机化并展示于噬菌体表面，以期筛选出耐药突变PR的敏感噬菌体，一方面可以研宄PR耐药突变对其切割序列的影响，同时还可尝试建立适用于耐药株HIVPI药物的噬菌体体外筛选模型。
为了保证筛选策略的成功，本研宄使用了LD3pCANTAB5S噬菌体，它是我们在筛选pmfcA和proteinL的单结构域组合文库中得到的有IsG高结合活性噬菌体114.将P2NC蛋白酶切割位点序列随机化的p2NC片段连接在上述载体中IgG结合蛋白LD3的C端，利用LD3作为固相化标记物将PR核心识别序列随机突变体噬菌体文库固定在人IgG包被的酶标板上，使用HVPR进行切割后，展示有敏感序列的噬菌体就可释放到溶液中而被富集。
本研宄对HIVgagCAP2NC的PR切割识别序列SATMMPRGN中的ATMMP易突变的核苷酸进行针对性随机化，其随机化的编码核苷酸序列设计为GGNNWNSWN SWWWWNSNN.对随机挑取的原始文库中10个阳性克隆的DNA序列分析表明，随机化位点的核苷酸呈随机性分布。
噬菌体展示文库的滴度为4.1X1015TU.ml-1符合进一步体外结合亲和筛选的要求。
该研宄在我们对HV1Gag蛋白p2NC蛋白酶切割位点SAT序列进行随机化基础上进行更有针对性，更多位点的随机化，增加了文库的随机多样性，为研宄PR耐药性突变对其敏感切割序列的影响及获得耐药突变HV 1蛋白酶敏感切割位点序列打下基础。
