基因RNA片段体外切割作用张欣，李弘剑，李月琴，何华坤，邹奕，周天鸿（暨南大学生物工程学系，广东广州510632）设计与之互补的引导序列（Gude SequentGS）将其共价结合至大肠杆菌核酶P催化亚基（MlRNA）的3末端，构建M1GST6核酶，并用其对UL7基因亚克隆片段转录产物进行体外靶向切割。可见转录出的RNA片段为单一纯净的电泳条带，其大小与底物RN\的预期值一致，为639坷经绿豆芽核酸酶平滑3末端，然后通过T7RNA聚合酶体外转录得到M1GS6RNA片段，用质量分数5%PAGE（含7mo/LUea行电泳，经银染显色，结果如所示。可见转录出的RN片段为单一纯净的电泳条带，其大小与核酶的预期值一致，为495nt M1GST6克隆质粒的琼脂糖电泳鉴定22核酶M1GST6的鉴定（1）以含有M1RNA基因（该基因位于T7启动子下游）的克隆质粒PFL17为模板进行PCR广增，得到的M1GS亥酶基因片段克隆至PC8质粒，获得M1GST重组质粒（）对其双酶切验证，产物片段为507bp 23核酶MlGST6对底物RNA的体外切割切割产物用质量分数6%变性PAGE电泳（含7mo/LUea）对切割的产物进行分离，放射自显影8h结果显示，和空白对照相比，M1GSI6实现了对底物RNA的切割，产生了符合预期大小的产物片段，其中5产物长度为610平3产物为29nt（片段屏蔽，一些本不能被M1GS所切割的靶位经热冷处理之后产生了切割，这点更充分说明了底物的二级结构对MlGS的活性有着很大的影响。
在底物浓度不变的前提下，加大酶浓度将促进酶切反应的进行。对RNsep的研究表明，该酶只有一个底物结合位点，而且周转效率很低。由于核酶、底物不可能是100%相互结合的，因此增加M1GS亥酶的用量必将促进单位时间内切割效率的升高。由本实验室以往的实验结果表明傲据未发表），适当提高M1GS核酶浓度后，切割效率明显提高，但过高的M1GS核酶浓度导致了底物RNA的消化，底物核酶比例达到大约1：2时出现了较好的切割现象，相关的实验有待进一步进行。
3讨论HCMV是一类严重危害免疫力低下以及免疫缺陷人群的病原体，该病毒在初次感染后绝大多数为无临床症状的隐性感染，病毒可长期潜伏在体内，甚至终身带毒；在免疫力低下、器官移植、放射损伤等条件下致后天感染或潜伏病毒再激活，引起严重症状显示出该技术是一种新型基因沉默技术。本文尝试利用RNaep勺基因沉默技术对HMVUL7基因进行靶向切割。我们根据原核EGS需要具备的几个基本特征：底物RNA剪切位点的3：5处分别是G和嘧啶U/C同时十2位为G+3位为C可提高切割特异性与切割效率，以及CCA-3游离末端等，设计出针对HCMVUL7基因mRNA位点的EGS将其共价连接到大肠杆菌来源M1RNA构建成核酶M1GST6体外切割实验证明其具备切割活性与序列特异性。
从可以看出，底物片段没有完全切开，这是由于M1RNA本身难以达到1%的切割效率，底物RNA的二级结构对M1GS的活性有着较大的影响，加上缺少C5蛋白对M1RNA结构的稳定以及金属离子浓度的影响，切割效率还有待进一步提高。
由本实验室以往所做的实验数据未发表）对底物RNA片段进行热/令处理后再进行切割反应，可*有报道指出，体外切割效率达到85%时，即可对HCMV病毒的抑制高达150倍，因此可以通过对M1GST6进行相应的改进，从而达到抗病毒制剂的要求。
本次体外切割实验为在体内实现基因沉默技术提供了依据，也可作为一种对病毒必需基因功能研究的手段。我们的研究结果表明，针对HCMVUL7基因构建高效高特异性的M1GS核酶是可行的，这为抑制胞内HCV复制提供了实验依据，也为及M1G现向抑制病毒基因表达的基因治疗策略奠定了实验基础。
