基金项目：上海市卫生局医学发展基金资助项目（SW034058）基于X染色体失活的克隆性分析方法是目前检测肿瘤克隆属性的重要方法之一，用此方法证明绝大多数恶性肿瘤都为单克隆性。而对宫颈鳞状细性1-和多克隆属性34均有报道，其研究结果不尽一致，可能与研究方法的不同有关。为了提高对病变的克隆属性和肿瘤的克隆性起源的认识，本研究通过对宫颈SCC及宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasiaCIN）以不同方法进行组织显微切割，检测同一病例以不同方法切割所显示的克隆性特点，分析单一位点和多位点组织显微切割方法对病变克隆性结果的影响及其意义。
1材料与方法1.1标本来源及分组标本采自同济大学附属东方医院病理科2004―2005年宫颈活检和手术病例，随机选取CINI 23例，CINE/I25例，宫颈SCC22例。另选取2例子宫平滑肌瘤标本为阳性对照非宫颈病变手术切除的正常宫颈组织20例为阴性对照。所有标本经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，由两名高年资病理医生对所有病例按照WHO（2003年）宫颈肿瘤组织学分类标准进行复诊。
1.2显微切割、DNA提纯和酶切每例蜡块连续10切片30张，铺于洁净载玻片上。切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，HE染色。用甘油缓冲液覆盖组织。在显微镜下用眼科手术刀片对病变上皮和间质分别进行组织切割。每例用两种方法切割：（）多位点微切割：取15张连续切片，切取病变上皮两个或两个以上位点。（2）单一位点微切割：另取15张连续切片分别刮取一个病变位点上皮和相应的间质。将每例显微切割组织分别置于0.加组织裂解液200M，蛋白酶Km（20mg.1厂1），55*C孵育过夜。95*C水浴10min灭活蛋白酶。酚-氯仿抽提基因组DNA，醋酸钠乙醇沉淀进一步纯化。geneQuant基因定量份样本DNA均一分为二，一组用甲基化敏感的限制性内切酶HpaE（NEB公司）酶切，另一组未经酶切为组内阴性对照。20W酶切反应体系：HpaE10~15U，10gnL―BSA0.2W，10X缓冲液2M DNA样品10W，加去离子水至总体积20M，37°C水浴孵育过夜，65°C20min终止反应。
1.3巢式PCR扩增AR基因5W1.循环参数：5 *C预变95°C变性60°C复性20个循环后72C延伸1min.取**轮扩增产物1W作为第二轮反应的模板，按上述反应体系扩增，循环参数：95C预变性10min95C变性45s61C复性30s72C延伸1min，30个循环后72C延伸10min. 1.4PCR产物的电泳检测20g/L琼脂糖凝胶电泳初评，取扩增成功的PCR产物2Wl加等体积甲酰胺上样缓冲液（90mlL一1甲酰胺，1gL一1溴酚兰，1gL一1二甲苯青）于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳100V2~3h.取出凝胶后置于含10%冰醋酸，30%乙醇的银染固定液固定15min，去离子水冲洗2次，各1min，1%硝酸浸泡10min，去离子水冲洗一次，用0. 2%的银染液染色30min，去离子水迅速冲洗30s预冷的3%Na2CO3显影液显色，至条带清晰，200~ 300bp之间出现两条带或一条带。凝胶分析系统记录数据并用ShineTech凝胶软件分析比较酶切前后的条带的光密度值。纯合子病例不进行克隆性分析；杂合子病表1例若酶切后只有一条带，或者两条带其中一条光密度减弱一半以上者即单克隆性病变，两条带光密度均衡即为多克隆性病变和85%宫颈SCC在酶切后出现一条带消失或者条带密度明显减弱。随着病变级别的加，单克隆性病变所占比例加，提示部分CIN病变的殖能力异常加，出现肿瘤性生长倾向。
我们同时采用多个位点显微切割的克隆性分析60%宫颈SCC是单克隆病变，其差别主要是全部的病变中有10例的多个病变位点呈不同的X染色体失活类型。因此单位点显微切割的病变若包含两种不同X染色体失活的病变，检测结果则表现为两条带，即为多克隆病变。因而这些病变实际上是一种假多克隆，并非是真正的多克隆性病变。因而宫颈癌的发生可能是单个克隆系的弥漫性生长，也可能是多个病灶的多个单克隆系同时生长。Hu等对多克隆性结肠癌和肺癌研究认为，癌发生过程中AR基因发生其他位点的甲基化，使限制性内切酶的酶切位点发生改变，影响了该方法的准确性。但对于宫颈癌，尤其是多克隆性的宫颈癌中没有类似的研究。
单点和多点组织微切割分析方法对单克隆病变的检出率不同，其差别有统计学意义（P因此对于某一个体不同起源的正常组织存在这组织特异性的甲基化形式，使得难于判断X染色体失活类型，因而需要选取来自同一患者的自身对照。本组实验中年龄大于65岁的患者6例，以间质组织为对照，并没有出现X染色体的非随机失活。
