特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定邓文生，杨希才，康良仪，田波（中国科学院微生物研究所，北京100080）同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录，将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合，37℃温育2h.结果表明，双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性，其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性，但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。
子病毒学，现在英国伦敦大学做博士后研究。
联系作者：杨希才马铃薯纺锤形块茎类病毒（potato spindle tuber viroid ，PSTVd）是引起马铃薯品种退化和产量降低的严重病害之一，已知PSTVd是在细胞核内复制和累积，难以用行之有效的茎尖脱毒法和传统抗病育种防治。根据马铃薯品种资源检测结果表明，国内外许多优良的马铃薯生产品种都不同程度的感染PSTVd ，严重地阻碍了马铃薯新品种选育和良种繁育。
核酶（ribozyme）是能催化或特异切割RNA的一类小RNA分子，通过对mRNA的切割，具有抑制基因表达的作用，因此成为控制病原物基因和其它有害基因的有力手段。近年来，国内外许多实验室在进行核酶控制RNA病毒和病害的研究并已取得进展[ 13].针对核酶能够专一切割含GUC核苷酸序列位点的特性，以及来自病原物的反义RNA具有抑制病原物正链表达的作用，我们以类病毒PSTVd为靶子进行研究，设计、合成并克隆了特异切割PSTVd正链和负链RNA的锤头型核酶基因。
体外活性试验表明，该核酶具有相当高的体外切割活性。应用植物基因工程技术将核酶转入马铃薯，经抗性筛选获得抗PSTVd侵染的基因工程马铃薯。在此基础上，为了增强核酶特异切割功能的表达，预防病原物PSTVd因突变而引起基因工程马铃薯抗性降低，我们推测构建特异切割PSTVd的多价核酶基因，使其更有效地切割PSTVd分子，达到控制马铃薯类病毒病的目的。本文报道构建特异切割PSTVd负链RNA的双价和三价核酶基因以及核酶体外活性测定的结果。
材料与方法质粒载体由本实验室提供。PSTVd双体克隆由美国Owens博士惠赠。
2核酶cDNA的合成寡聚脱氧核糖核苷酸片段由中国科学院微生物研究所生物技术中心用Beckman oligo 1 000m/ 1 000合成仪合成。
Klenow酶购自Promega公司。体外转录试剂盒购自P] GTP购自美国杜邦公司。
DNA连接酶购自Gibco BRL公司。常规试剂为国产分析纯。
4特异切割PSTVd负链双价和三价核酶的设计根据锤头型核酶结构特点及选择底物切割位点，以PSTVd负链RNA作靶序列，选择负链（5′※3′）第和235核苷酸处的GUC作靶位点，设计一个双份锤头结构的核酶，称之为双价核酶（RzD）。其中负链第至234序列与两个锤头结构核酶之间的序列互补配对第236至244之间序列为双价核酶5′端互补配对区，第197至209之间序列为双价核酶3′端配对区，双价核酶全长89个核苷酸（nt），图1为所设计的含有切割两个位点的锤头型双价核酶核苷酸序列。单价核酶双体（专一切割PSTVd负链第324核苷酸含GUC位点）来自实验室早期构建的基因片段。双价核酶与单价核酶双体连接后插入质粒载体中以构建含有切割3个位点的三价核酶病毒学报5核酶基因的合成、克隆和鉴定双价核酶cDNA序列分A、B两链合成， A链为50个碱基， B链为51个碱基，其中， A链3′端与B链3′端分别有13个碱基互补。为获得全长基因，将等量A链和B链混合， 95℃变性3min后室温下退火，用Klenow酶补平得到双链DNA.取少量补平的双链DNA作为模板，加入适量引物进行PCR扩增。引物序列分别为：别含有限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点。基因扩PCR产物用Xba I和Kpn I限制性酶消化后，与用相同内切酶消化的pGEM7Zf（）载体相连。所用连接酶为接4h.转化受体菌为E.coli DH5α，感受态细胞采用PEG法制备。经转化、涂皿，采用蓝白斑筛选重组子。挑取白斑克隆菌在LB培养液中培养过夜，碱法提质粒，质粒酶切后经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定阳性克隆。将获得的含核酶基因的质粒进行序列分析，采用双脱氧末端终止方法测序。为获得三价核酶的克隆，将序列正确的双价核酶基因与单价核酶双体基因相连。克隆的策略如图2.
6体外转录和核酶体外活性测定分别提取载有核酶基因和PSTVd双体基因的质粒，用限制性内切酶酶解使模板线性化。对于双价和三价核酶转录用质粒分别用HindⅢ和SacⅠ酶切， PSTVd双体负链的转录用质粒则用HindⅢ酶切。核酶和底物的转录按照宝灵曼转录试剂盒提供的方法进行，底物的转录需添加α[ P] GTP.转录完毕用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提2次，加入1/ 10体积4mol/ L NaAc和3倍体积冷无水乙醇沉淀，沉淀物分别溶于DEPC处理过的水中。取样在8 聚丙烯酰胺凝胶（含8mol/ L尿素）中电泳检查转录产物质量。
核酶与底物以适量的比例混合， 37℃（或25℃）条件下2.温育完毕加入终止缓冲液（98 甲酰胺， 10mmol/ L EDTA， 0.2 溴酚蓝）95℃变性30s后置冰浴。在8 聚丙聚酰胺变性凝胶（8mol/ L尿素）中电泳进行放射性自显影。
结果1核酶基因的克隆和鉴定将双价核酶与pGEM7Z载体连接物转化大肠杆菌。根据蓝白斑筛选方法挑取白斑克隆菌培养过夜，所提质粒用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切后5 聚丙烯酰胺平板胶上进行电泳分析。将获得含双价核酶基因（95bp ，含内切酶碱基序列）片段的重组质粒进行序列分析，序列完全正确的重组质粒用KpnⅠSacⅠ双酶切后连接含相同酶切位点的单价核酶双体基因片段，获得串联的三价核酶基因（图2）。内切酶酶切鉴定表明，用XbaⅠSacⅠ双酶切，得到193bp的三价核酶基因片段（图3 ，样品1）用XbaⅠKpnⅠ双酶切，得到95bp双价核酶基因片段的单价核酶双体基因片段（图3 ，样品3）。说明在获得含双价核酶基因质粒的基础上，构建出含三价核酶基因的重组质粒。将这两种重组质粒用内切酶处理线性化后，作为模板进行转录，将获得双价或三价核酶转录物。
2体外转录线性化的模板用低熔点琼脂糖凝胶回收纯化后，核酶基因在T RNA聚合酶作用下进行转录， PSTVd双体基因在SP RNA聚合酶作用下进行转录，转录时掺入适量α[ P] GTP ，但用于切割反应的核酶不需4期邓文生等：特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定掺入同位素。转录完毕后，分别取微量转录物进行8 聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，放射性自显影检查转录的效果。检测结果表明，转录的底物和转录的核酶都显示一条清晰的带，说明转录得到较高纯度的二价核酶（152nt）和底物（762nt）。同样的方法，获得了长度一致的三价核酶转录物，全长为223nt.
3核酶体外活性测定PSTVd负链双体转录物全长718nt ，加上来源于载体的核苷酸，共762nt ，理论上底物被双价核酶切割后，应分别生成321nt、335nt和58nt的3个片段（图4b）。图4a是在37℃保温底物被双价核酶切割后的放射自显影图谱。正如所预期的那样，图中在相应位置分别显示了321nt、335nt和58nt 3条带。根据自显影信号强度可以看出，绝大多数底物被切割了，而不加核酶的对照底物信号强度很强，且并没有出现相应产物带，这说明双价核酶在体外具有较高的特异切割活性。
按理论值推算，PSTVd双体负链被三价核酶切割应产5个长度片段，其大小分别为24nt、58nt、75nt、89nt和246nt.然而自显影结果显示了3条带，分别为359nt、328nt和75nt.此结果与三价核酶中的单价双体核酶切割的理论值相似（图5b）。
当底物浓度为2.2×10 mol/ml时，随着核酶浓度底物信号强度越来越弱，产物的信号强度越来越强，病毒学报16卷说明三价核酶在体外具有较强的切割活性，尽管只是其中一价核酶在起作用。
讨论由图4、图5可以看出，双价核酶和三价核酶在37℃保温下都具有较高的切割活性。然而田间条件气温很少达到37℃。在室温对双价核酶和三价核酶的活性研究表明，核酶在25℃保温下仍具有较高的切割活性，因此可以认为温度不会成为核酶起作用的限制因子。对双价核酶和三价核酶不同反应时间的切割效果研究表明，当核酶和底物浓度一定时，反应30min和反应2h的自显影结果是相似的，这可能与锤头型核酶反应发生在极短时间内有关研究表明，以类病毒负链为靶序列，转核酶基因作物表现出对类病毒有抗性，而以正链RNA为靶序列则表现出很低的抗性链上第、235和324核苷酸GUC为切点，构建了一个双锤头组份结构的双价核酶和4锤头组份结构的三价核酶。由于它能切割两个以上的靶位点，因此即使病原物PSTVd出现变异，多价核酶亦能具有切割功能，使病原物PSTVd的滚环复制受到抑制。
如图5a所示， PSTVd底物被锤头型三价核酶切割后并没有出现所预期的结果，起作用的只是单价核酶，这可能是多价核酶与底物的竞争结合引起的。三价核酶含有一分子双价核酶序列（针对位点）和两分子单价核酶（针对PSTVd负链第322～324的G UC为靶位点），当核酶与底物亲和结合时，两分子单价核酶更容易与底物结合，导致相应的切割效应。
由于双价核酶本身具有对PS TVd的切割功能，三价核酶对PSTVd的3个位点中任何一个位点的切割都能阻断PS TVd的复制。在此基础上，我们已将双价核酶基因和三价核酶基因分别构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导转化马铃薯，经过一系列抗性筛选和田间试验，将培育出抗PSTVd侵染的转基因马铃薯。
叶寅，刘怡之，赵丰，等。特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒的4期邓文生等：特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定
