商来宝
  • 供应
  • 求购
  • 企业
  • 展会
  • 资讯

微信公众号

商来宝微信公众号
当前位置: 首页 » 行业资讯 » 综合资讯 »HIV Gag CAP2NC噬菌体蛋白酶切割模型的构建

HIV Gag CAP2NC噬菌体蛋白酶切割模型的构建

放大字体  缩小字体 发布日期:2021-10-10 11:07:05 来源: 作者:用户20586    浏览次数:0    
摘要

生物化学与生物物理进展蛋白酶切割模型的构建1贾建安12周波2)蒋少华u陈秋莉u赵平1潘欣1:|温宗梅2)邓松华2)卢洪洲3)潘卫i)m第二军医大学微生物教研室,上海200433;2)安徽医科大学病理学教研室,合肥230032;3)上海市公共卫生中心,上海201508)文库的噬菌体进行切割筛选,可获得突变PR的敏感噬菌体,该噬菌体可用于针对HIVPR耐药突变株的蛋白酶抑制剂(proteaseinhi...

生物化学与生物物理进展蛋白酶切割模型的构建1贾建安12周波2)蒋少华u陈秋莉u赵平1潘欣1:|温宗梅2)邓松华2)卢洪洲3)潘卫i)m第二军医大学微生物教研室,上海200433;2)安徽医科大学病理学教研室,合肥230032;3)上海市公共卫生中心,上海201508)文库的噬菌体进行切割筛选,可获得突变PR的敏感噬菌体,该噬菌体可用于针对HIVPR耐药突变株的蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor,PI)新药筛选。为了探索这一可能性,将包含HIVPR靶位点P2/NC序列的Gag蛋白CAP2NC片段展示于噬菌体表面,并在该片段的N端连接一可与人免疫球蛋白分子特异结合的固相化标签序列LD3,将该噬菌体固定于人免疫球蛋白包被的酶标板上,用HIVSF2PR进行切割,用抗M13噬菌体酶标抗体ELISA法检测未被切割的剩余噬菌体以反映切割效果。结果表明,所构建的噬菌体能被HIVPR有效切割,*大切割效应可达80%以上,其ELISA检测值明显下降,并且该切割效应与HIV PR呈明显的量效关系,能被PI类药物Indinavir(IDV)特异抑制。首次成功构建了展示HIVGagCAP2NC片段的噬菌体蛋白酶切割模型,不仅可为研宄HIVPR的耐药性变异及其靶序列的适应性变异提供一新的研宄平台,同时也为构建一种全新的PI类药物,尤其是针对耐药的PI类药物大规模体外噬菌体筛选模型打下基础。

学科分类号Q78 HIV蛋白酶(HIVPR)通过切割HIVGag与Gag-Pol融合蛋白促进病毒颗粒的成熟,缺少活性蛋白酶的原病毒DNA只能产生无感染性的幼稚型病毒颗粒。HIVPR通常作用于Gag与Gag-Pol中2种主力药物之一,现有的抗HIV蛋白酶抑制剂类药物是根据PR结构设计的PR靶位点P1-P1,位相似物,通过竞争结合PR的底物结合部位,使PR无法有效发挥切割作用,从而达到抑制病毒复制的目的。然而,近年来,对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的耐药HIV变异株的出现,较大地影响了HAART的治疗效果。研究表明:HIVPR的99个氨基酸中己发现有21个位点可产生与耐药相关的突变,这些突变可引起HIVPR对目前临床应用的6种PI药物发生耐受和底物法,二者均不能直接用于针对耐药突变株的筛选,因此,建立新的针对耐药HIV的新药筛选模型是抗耐药突变HIV新药开发的重要工作之一。

利用噬菌体展示技术,将外源多肽随机突变体展示于噬菌体构建噬菌体展示文库,并用特定筛选方法可以获得具有特定性状的突变体,这一研究手段己广泛应用于各方面的研究。本研究组己展开HIVPI类药物新型噬菌体筛选模型的研究工作,目前,己构建展示HIVPR靶位点序列随机突变的噬菌体文库,应用不同HIVPR以及耐药突变的PR对其进行切割筛选,理论上可以获得对不同PR高敏感性的噬菌体。如果这些噬菌体能固定于酶标板上,并能被HIVPR有效切割,并且这种切割效应能很方便地被检测出来,那么这样的噬菌体切割模型具备了用于HIVPI类药物大规模体外筛选的条件。

然而,展示于噬菌体表面的HIVPR靶位点序列能否被HIVPR切割,这一切割效果能否被常规方法(如ELISA)有效地方便地检测出来,这些是首先要回答的问题,也是研发HIVPI类药物噬菌体筛选模型的核心问题。本研究,将HIV-1HXB2株CAP2NCDNA克隆于噬菌体展示载体的人免疫球蛋白结合序列LD3的C端构建融合蛋白,构建含有固相化标记的展示HIV-1Gag蛋白P2/NC蛋白酶靶位点序列的噬菌体pCANTAB5S-LD3-CAP2NC,用HIVSF2PR对固相化的噬菌体进行切割分析,用抗M13噬菌体酶标抗体ELISA法检测HIVSF2PR的切割效果,以证实构建展示HIVCAP2NC片段的噬菌体蛋白酶切割模型的可行性。

1材料和方法1.1质粒、菌种白的N端,展示IgG高活性结合分子LD3的重组噬菌体载体,该载体所带的IgG结合分子LD3可作为固相化标记,将噬菌体固定于包被人IgG的酶标板上。pMD18-T-CAP2、pMD18-T-NC是以pMP18-T为载体的重组质粒,其目的基因分别编码HIV-1型M组B亚型的代表株HXB2株衣壳蛋白(CA)与P2蛋白的融合蛋白(CAP2;GenBankNO:AF033819;CAP2氨基酸序列为Gag蛋白上第133位到430位氨基酸),及核衣壳蛋白(NC;GenBankNO:AF033819;NC氨基酸序列为Gag蛋白上第431位到488位氨基酸)。上述质粒为本室构建。HIVCAP2NC片段中存在2个PR靶位点CA/P2和P2/NC,本研究,选择P2/NC序列作为PR切割对象,为了避免CA/P2位点的影响,我们对CA/P2位点进行了突变,将第231位L突变为G,232位A突变为G,突变后的CA/P2位点将不会被HIVPR特异性切割。原核表达载体pQE30及其宿主菌E.coliM15购自德国QIAGEN公司。辅助为本教研室保存。

1.2试剂HIVSF2PR为HIV-1型B亚型SF2株PR,由美国Scripps研究所Elder教授惠赠。HIVPI类药物Indinavir(Crixivan)由Merck公司生产,由上海公共卫生中心卢洪洲教授惠赠。LD3纯化蛋白为pET32a(+)/BL21系统(购自Novagen公司)表达,由本室自制。DNATaq酶、PCR溶液DNA回收试剂盒,购自上海申能博彩科技公司,T4DNA连接酶(LigationHighkit)购自TOYOBO公司,限制性内切酶StuI、SalI、BamHI均为TaKaRa公司产品,辣根过氧化物酶标记鼠抗M13噬菌体单克隆抗体(anti-M13-HRPmonoclonalconjugate)购自AmershamPharmacia公司。质粒DNA提取试剂盒,DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁公司。金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)购自德国QIAGEN公司。1.3引物对HIV-1CAP2和NCDNA片段进行PCR扩的引物见表1.用于扩CAP2片段的上游引物C1Bu-stu引入StuI、XbaI酶切位点。用于扩NC片段的下游引物C1Ld-6引入SalI酶切位点,上游引物C1Lu-1a引入CAP2片段3'端重叠区域;用于测序的下游引物pCANTAB5-S6为5'GTA CAP2NCDNA和带有人免疫球蛋白结合序列LD3的LD3-CAP2NCDNA,构建表达载体的上游点。上述引物委托Invitrogen公司合成。

为引物扩NC片段,Taq酶1U,50ul反应体积,扩条件为94°C40s;56°C40s;72°C60s;30个循环。PCR产物于1.2*%琼脂糖凝胶电泳分析。

个循环。PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳分析、试剂盒溶液回收。

展示HIVCAP2NCDNA的噬菌粒构建将CAP2与NC重叠PCR溶液回收产物StuI和SalI双酶切过夜,试剂盒胶回收。将HIVCAP2NCDNA的StuI和SalI酶切回收产物,与限制酶StuI和SalI消化后的pCANTAB5S-LD3载体连接并转化E.coliTop10F,。提取单克隆质粒,限制酶酶切筛选重组克隆,选择鉴定正确的3个单克隆进行序列测定,测序正确的噬菌粒命名为pCANTAB5S-LD3-CAP2NC.白表达载体的构建片段。Taq酶1U,50ul反应体积,扩条件为30个循环。试剂盒回收PCR产物用BamHI和SalI双酶切过夜,与BamHI和SalI消化后的原核表达载体pQE30连接并转化E.coliTop10F,。限制酶酶切筛选重组克隆,选择鉴定正确的3个单克隆进行序列测定,测序正确的质粒命名为pQE30-CAP2NC.影响,我们构建了LD3-CAP2NC融合蛋白的有表达载体。以pCANTAB5S-LD3-CAP2NC噬菌粒为模扩条件为94*C40s;55*C40s;72*C120s;30个循环。PCR产物用BamHI和SalI双酶切过夜,试剂盒回收后与限制酶BamHI与SalI消化后的原核表达载体pQE30连接并转化E.coliTop10F.提取单克隆质粒,限制酶酶切筛选重组克隆,选择鉴定正确的3个单克隆进行序列测定,测序正确的质粒命名为pQE30-LD3-CAP2NC.白的表达与纯化取诱导后菌液1ml,离心收集菌体,加20ul2倍SDS加样缓冲液,振荡混匀后100C加热7min,用10*%SDS-PAGE鉴定表达结果。挑选表达量较高的菌种进行目的蛋白的大量诱导表达和纯化:将pQE30-CAP2NC/M15、pQE30-LD3-CAP2NC/M15的过夜培养物50ml接种于500mlLB培养基,剧烈振摇4h,加入IPTG至终浓度为1mmol/L,诱导3.5h,离心收集细菌沉淀,8mol/LpH8.0尿素裂解过夜,离心收集上清用于纯化,纯化按Qiagen公司Ni-NTA使用说明书进行。经SDS-PAGE确定纯化效果。Brade-ford法595nm下测定目的蛋白浓度。

白的体外切割分析后于37*C孵育16h,反应完成后,每一反应体系加入20ul加样缓冲液,振荡混匀后100C加热7min,用10*%的SDS-PAGE鉴定切割效果。

1.9展示HIVCAP2NC蛋白的重组噬菌体的制备化培养1h后加入1ml的M13KO7辅助噬菌体拯救,37C,250r/min振荡培养1h,000g离心10min,细菌沉淀用10ml2>YT(含氨苄青霉素100mg/L和卡那霉素50!g/L)悬浮,37C,250r/min振荡培养过夜。培养液上清加入中,经0.22um滤膜过滤,分别获得pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌体。取1ul重组噬菌体10倍系列稀释,感染对数生长期的E.coliTG1,37C培养1h后涂SOB(含氨苄青霉素100mg/L)平板,置37C培养过夜。计数不同稀释度平皿上的菌落数,生长菌落数的稀释倍数乘以100即为每毫升噬菌体的转化单位数(transformationunit,TU)。

1.10展示HIVCAP2NC蛋白的重组噬菌体体外蛋白酶切割模型的构建培养液将PCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌体均调整至1.0Xl012TU/ml后,分别取噬菌体100ul,加入包被有人IgG抗体的反应孔中,37*C孵育3h后洗涤10次。每孔加入不同稀释度的HIVSF2PR至噬菌体酶标抗体,37C孵育45min后加入TMB显色,测A*值,每种PR浓度各作3复孔,取平均值计算切割率。切割率=(未加PRA*均数-(加入PR后A450均数-对照A450均数))/(未加PRA450均数-对照A450均数)。

CAP2NC蛋白的重组噬菌体的作用0.02),表现出较好的特异性作用。

加入HIVSF2PR后,结合于板上的pCANTAB5S-LD3数量也有减少,但在10mg/LPR时*多仅减少了约61%,小于HIVSF2PR切且减少程度与HIVSF2PR浓度无相关关系,说明二者没有表现出特异性的作用。

CAP2NC蛋白重组噬菌体的抑制作用浓度的HIVSF2PR反应,分成2组,一组中加入PI类药物Indinavir(IDV)至3mg/L,另一组不加Indinavir,反应结束后在样品孔中加入抗M13噬菌体酶标抗体,测A450值。如表3、所示,同时加入HIVSF2PR与Indinavir组,结合于板上的PCANTAB5S-LD3-CAP2NC数量明显高于仅加入HIVSF2PR组,且与对照组结合于板上噬菌体数量相当,说明PI特性抑制PR对CAP2NC的特异切割。Indinavir同样抑制PR对LD3的非特异切割(表3,)。

3讨论随着临床PI的使用,出现愈来愈多的耐药突变。HIVPR通过突变来逃脱PI类药物的作用,如30位Asp突变为Asn可引起对Nelfinavir耐受,48位Gly突变与90位Leu突变可以导致Saquinavir耐受;用Indinavir治疗的病人产生了对Saquinavir和Amprenavir的交叉耐药性。HIV不仅PR发生突变,PR的靶序列也随之发生适应性突变以补偿PR突变所造成的病毒复制率的下降,P2/NC位点是适应性突变发生*多的位点,通过测定待筛药物对信号分子标记的现有PI竞争抑制作用来筛选,但无法筛选针对突变的PR的PI候选物。另一方法是底物法,通过测定对PR酶解标记荧光淬灭分子的短肽靶序列底物的抑制作用进行筛选,该法的缺陷是,底物序列仅为PR靶位点序列本身的数个氨基酸,未能考虑到靶位点侧翼序列以及整个靶蛋白构象对PR切割的影响,另外,如要针对突变的PR进行筛选,必须重新建立新的底物分子。

本研究组一直从事噬菌体展示靶蛋白文库的构建和筛选工作,积累了一定的工作经验和研究基础,在这一基础上,我们试图建立能适用于针对PR突变进行筛选的HIVPI噬菌体体外筛选模型。首先构建展示HIVPR靶位点P2/NC序列随机突变的噬菌体文库,拟用IgG分子将其固定于酶标板上,通过应用包括突变PR在内的各种HIV PR对该文库进行切割筛选,获得各自敏感的噬菌体,*终用于构建针对各种不同PR的噬菌体体外PI类药物筛选模型。

由于国内外尚无类似这样的噬菌体药物筛选模型建立的报道,因此,该策略的可行性至关重要,虽然HIVPR能切割噬菌体随机肽库,并获得敏感噬菌体,但对展示在噬菌体表面的分子质量较大,并包含较完整侧翼序列的靶序列是否仍能有效切割,对融合有固相化标记的并固定在酶标板上的噬菌体仍能否有效切割,其切割效率是否足以大到能用ELISA测定明显地反应出来,这种切割效应是否稳定,并具有特异性,本研究的结果较为清楚地回答了这些问题。

首先,我们选择p2/NC靶位点序列展示于噬菌体表面。因为在HIVPR的数十个靶位点中,p2//NC与TF(转位蛋白)/PR之间的是*快的靶位点,同时,每个靶位点都可以发生不同程度的适应性突变,其中p2/NC处的突变率高达52°%,是突变率*高的位点。将P2/NC序列展示于噬菌体表面,相对较易被PR切割,而利用该位点构建PR靶位点随机突变文库时,也更有可能得到PR敏感的随机突变体。

尽管HIVPR对其靶蛋白的切割研究己有广泛报道,但不清楚我们所选择的切割模型在我们的,HIVSF2PR可以很好地切割CAP2NC蛋白,在0.2tg时将CAP2NC蛋白完全切割,对融合有重组LD3分子的LD3-CAP2NC蛋白也有明显的切割,PR在2tg时,LD3-CAP2NC蛋白可被部分切割开来,然而,LD3分子并未表现出被切割的迹象。因此尽管融合了LD3分子后,CAP2NC蛋白对PR切割的敏感性虽然降低,仍然可以被HIVSF2PR特异性切割,说明对靶位点的选择和PR的切割是完全成立的。

在展示HIVCAP2NC蛋白的噬菌体构建中,我们选用了pCANTAB5S-LD3噬菌体载体,该载体带有LD3分子作为固相化标记。LD3分子具有与IgG高亲和性的特性,便于噬菌体的固定,同时该类分子为本室自行构建的新的进化分子,其性状己经非常清楚,技术成熟,便于使用。所制备的噬菌体pCANTAB5S-LD3-CAP2NC和pCANTAB5S-LD3重组噬菌体的滴度与pCANTAB5S噬菌体相同,都达到1012TU/ml以上,说明展示大分子质量的LD3-CAP2NC没有对噬菌体的滴度形成影响,而在噬菌体切割模型的建立中,每孔仅需投入1>40nTU的噬菌体,因此,上述噬菌体滴度无需进一步浓缩,可直接稀释应用,完全可满足大规模筛选的要求。

本研究利用HIVSF2PR切割展示于噬菌体表面的蛋白酶靶位点P2/NC序列,取得了较为显著的效果(),加入HIVSF2PR后,结合于板上10mg/LPR时减少约80°%,且切割率与PR浓度呈相关关系,表现出较好的特异性作用,用HRP抗噬菌体抗体ELISA检测切割效果的A值下降非常显著,肉眼就能很明显地分辨出颜色的变化。不仅如此,HAART中常用的PI类药物Indinavir对HIVSF2PR切割展示于噬菌体表面的CAP2NC有良好的抑制作用(),表明,该模型己可满足对PI类药物候选物进行体外大规模筛选的基本条件。

另外,该切割反应具有很好的稳定性,我们先后在1年内对该噬菌体切割实验进行了几十次的重复,每次都取得相同的切割效果(结果未示)。

令我们意想不到的是,HIVSF2PR对pCANTAB5S-LD3也表现出切割效应,在10mg/LPR时*多能减少了约61%,且该效应也可被Indinavir所抑制。与对pCANTAB5S-LD3-CAP2NC的切割不同,其切割效应与PR浓度无明显的量效关系(),推测该切割效应为非特异性作用。然而,在体外LD3分子并未表现出被HIVSF2PR切割的迹象()。噬菌体上产生非特异切割的原因可能是:a.噬菌体上存在着其他影响HIVSF2PR切割的因素,展示于噬菌体表面LD3分子构象可能受到噬菌体自身蛋白质的影响,从而容易被切割;b.在噬菌体切割体系中,HIVSF2PR的相对浓度要比体外切割时的浓度高出许多,这也是产生非特异性切割的原因之一;此外,可能有其他影响因素如pH、离子因素等也可能对HIVSF2PR活性造成影响,产生了非特异性切割。

本研究中使用了完整的PR靶蛋白CAP2NC展示于噬菌体表面并用于HIVSF2PR的切割,因此能够较好地模拟PR切割底物的真实情况;该方法简便易行,并可针对不同的PR设计不同的靶位点,具有很好的扩展性;同时该模型基于噬菌体展示技术与ELISA方法,重复性好,并具有较高的敏感性,适于进行高通量的PI类药物筛选。

本研究首次将HIV蛋白酶的靶蛋白CAP2NC展示于噬菌体表面,并用HIVSF2PR切割,成功构建基于噬菌体展示HIVPR靶蛋白的噬菌体PR切割模型,证实了体外应用噬菌体展示技术筛选PI类药物的可行性,为构建展示HIVPR靶位点序列的噬菌体体外PI类药物筛选模型打下了基础,也为研究HIVPR耐药变异与其靶序列适应性变异的相互关系提供一种新的研究平台。

致谢感谢美国Scripps研究所的JohnElder教授惠赠HIVSF2株蛋白酶及对本研究提出的宝贵建议,感谢美国Scripps研究所Ying-ChuanLin博士在纯化并表达HIVSF2株蛋白酶中的辛勤工作。感谢美国AaronDiamond艾滋病研究中心的黄耀新博士对本研究提出的宝贵建议。

 
举报 收藏 0
免责声明
• 
转载请注明原文出处:https://www.51slb.com/news/effb070371.html 。本文仅代表作者个人观点,与商来宝平台无关,请读者仅做参考,如文中涉及有违公德、触犯法律的内容,请向我们举报,作者需自行承担相应责任。涉及到版权或其他问题,请及时联系我们处理。
 

(c)2022-2032 www.51slb.com 商来宝 All Rights Reserved 成都蓝兴网络科技有限公司

蜀ICP备2021023313号