著特异性脱氧核酶对喉癌真核细胞起始因子4E基因mRNA的体外切割作用滕博，辛丁，文连姬，王君影，崔树勋，金舂顺（吉林大学第二医院耳鼻咽喉科，吉林长舂130041）目的研究特异性脱氧核酶（10-23DNAzyme）对喉癌真核细胞起始因子4E（eukaryoticinitiationfacto「-4E，eIF4E）基因mRNA的体外切割作用。
方法设计合成针对原癌基因eIF4EmRNA编码区的1102、1289、1226位点的3个10-23DNAzyme-eIF4E，用内切酶XhoI将含有eIF4E基因mRNA的pGEM-7zf+eIF4E质粒消化成线性。以此为模板体外转录出用UTP标记的靶eIF4E基因编码区mRNA.在37°C，pH7.5，Mg2+离子50应，并比较不同Mg2+离子浓度下酶对靶mRNA的切割活性。反应产物在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并行放射自显影，应用凝胶成像分析仪评价酶的切割效率。结果在设定条件下，3个10-23DNAzyme-eIF4E对eIF4E基因mRNA均有切割活性，且随着Mg2+浓度越高，酶的切割活性增强。结论3个10-23DNAzyme-eIF4E能有效切割eIF4E基因编码区mRNA，且切割效率与"浓度有关。
DNA，催化性；真核细胞起始因子4E；基因疗法；喉肿瘤近年来的研究表明，某些DNA或RNA分子也具有酶活性，能够特异性识别和切割靶mRNA分子，影响和调控特定基因的表达，从而打破了酶分子均为蛋白基金项目：吉林大学青年创新基金项目（K205）**及通讯：滕博，女，吉林人，医学博士，主治医师，主要从事耳鼻咽喉头颈外科的临床工作及头颈肿瘤的基因治疗研究。Email：tengbo1975163.com通讯作者：辛丁（Email：xinding1963163.com）质的传统观念。由DNA分子组成的脱氧核酶比RNA分子组成的核酶更容易合成，前者的稳定性也明显高于后者，目前已通过酶工程学等方法合成了100种左右具有RNA切割活性的脱氧核酶，其中*引人注目的是10-23DNAzyme.本研究合成针对喉癌eIF4E基因编码在体外对靶mRNA的切割作用，初步探索其成为基因药物治疗的可能性，现报道如下。
1资料与方法特异性结合，通过两步转酯化反应而使靶RNA分子裂解。针对eIF4E基因mRNA编码区不同位点设计质粒。pGEM-7zf+eIF4E质粒，为载有喉癌eIF4E基因编码区mRNA的体外转录载体，由吉林大学基础实验室从喉癌Hep-2细胞株中提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR）扩增出eIF4E基因编码区647bp的cDNA序列，建成含有T7启动子的pGEM-7zf+eIF4E质粒。
克生物工程公司合成。
1.3主要试剂。质粒提取试剂盒及限制性内切酶购于Takara公司。T7转录试剂盒购于德国Roche公司。
UTP购于北京福瑞生物医学工程公司。
1.4切割底物的制备。限制性核酸内切酶XhoI（3pl）将pGEM-7zf+eIF4E质粒（10pl）线性化，将线盒），及无RNA酶的水充分混匀，在37*C反应2小时。
0.2mol/L的EDTA中止反应，RNA转录产物经乙醇沉淀，用适量无RNA酶水重溶，-80C冻存备用，所有容器和溶液均经严格去RNA酶处理。
条件下，反应60分钟。对照组为未加10-23DNAzyme-eIF4E的阴性对照。加入100mmol/L的EDTA中止反应，立即进行8°/.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（1700V；120mA），放射自显影。
分别为100、50、25、10mmol/L的反应条件下，反应60分钟。对照组为未加10-23DNAzyme-eIF4E的阴性对照。其余步骤同前。
种序列特异性限制性核酸内切酶，其催化活性中心序列有15个脱氧核糖核苷酸组成，活性中心两端为底物识别区，可通过Watson-Crick碱基配对与靶RNA切割反应。针对不同位点10-23DNAzyme-eIF4E对靶mRNA的切割活性经薄层图像扫描分析，脱氧核酶对靶mRNA的切割效果（）。
mRNA的切割反应（）。经凝胶分析系统，Mg2+浓%、40.65%、31.24%.可见随Mg2+浓度增加，DRz3的切割效率也在增强。
2不同Mg聊喉癌是东北地区*常见的、患病率较高的恶性肿瘤，其发病率目前有明显增长趋势，近年虽然诊断和治疗方面取得了很大的进展，但总的生存率仍较低，而且迄今采用的传统的三大治疗手段，手术、放疗和化疗对晚期、复发、转移的喉癌疗效都很不理想，往往有一定致残率，降低了患者的生存率及生存质量。
随着肿瘤分子生物学发展，大多数学者已经证实肿瘤的发生发展与多种基因之间关系密切，通过改变或修饰相关基因及其表达产物的方式治疗肿瘤已成为肿瘤生物治疗*引人注目的领域。
elF4E是新近发现的原癌基因，是**个在喉癌中100%过度表达的原癌基因，主要通过调控肿瘤恶性相关基因的核质转运或翻译致癌，在正常组织中不表达或低表达，而在头颈部磷状细胞癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌及非霍奇金淋巴瘤等实体瘤的发生发展中起重要作用。高水平的eIF4E蛋白促进肿瘤细胞生长、分化、增殖、抗凋亡及转移的发生，这一特性有可能使它成为头颈肿瘤基因治疗的潜在靶点。
调节eIF4E的水平和活性达到生理状态的药物也可为抗癌药物的研制提供一条新思路。
1997年Santoro和Joyce从体外筛选获得一类有催化活性的DNA分子，其中之一为10-23DNAzyme.通过合理设计10-23DNAzyme底物识别部位的核苷酸序列，就能对任何含有嘌呤/嘧啶交汇点的RNA进行切割。目前国内外已有一些学者应用脱氧核酶进行细胞内外切割特异性RNA的研究并获得成功，如：以HIV-1V3环区为靶位点的脱氧核酶能在体外转录系统中有效切割靶RNA保守序列，抑制病毒在细胞内的复制；Cairns等合成的脱氧核酶在体外实验中有效抑制人乳头瘤病毒的基因表达；以原癌基因c-mycRNA翻译起始区为靶序列的脱氧核酶在体外能有效切割其全长底物，下调c-myc在平滑肌细胞内的基因表达，抑制细胞的增殖；Yen等设计的脱氧核酶在细胞内以序列特异性的方式切割亨延顿舞蹈病基因，降低蛋白的表达等等。而有关脱氧核酶对肿瘤原癌基因表达抑制作用的研究报道较少。我们为观察特异性脱氧核酶对喉癌eIF4E基因靶mRNA的体外剪切活性，用内切酶XhoI将质粒pGEM-7zf+eIF4E完全线性化后，以之为模板进行体外转录，经8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影证实可获得足量纯化放射性标记的底物RNA.在pH7.5和Mg2+50mmol/L等条件下，将3个10-23DNAzyme-eIF4E与底物RNA（10nmol）混合反应，结果显示3个脱氧核酶均有一定的剪切活性，可有效切割eIF4E基因靶mRNA，为将来在细胞和动物水平的实验中控制eIF4E低表达奠定了基础。
本研究在脱氧核酶体外反应体系中加入MgCl2，这是由于类似的研究发现脱氧核酶的切割活性依耐于二价阳离子的存在，尤其是镁离子是维持其切割活性所必需的二价阳离子。Mg1234+离子不仅有助于脱氧核酶折叠成活性结构，而且还直接参与了切割反应，是绝大多数脱氧核酶赖以发挥活性的关键条件之一，脱氧核酶的催化速率会随金属离子浓度的升高而升高。
本实验证实了这一点，在相同条件下，Mg2+离子浓度越高，10-23DNAzyme对靶mRNA的切割效率越高，在Mg2+离子浓度达100mmol/L时，酶切效率达*大值。
尽管自然界中尚未发现天然存在的脱氧核酶，但这些人工合成的特殊的DNA分子所展示的生物催化功能依然是令人振奋的，如何发现DNA新的催化功能和更多种类的脱氧核酶，如何将脱氧核酶发展成为新型基因治疗药物，还需要人类进一步的深入研究。
