评述第卷第期年月科考五叙人工核酸切割试剂研究进展万荣赵刚陈晶麻远赵玉芬清华大学牛命科学与一程研究院，化学系生命有机磷化学教育部开放实验室，北京联系人。
人工核酸切割试剂尤其是定点切割试剂在生物化学和分子生物学领域中有着重要的应用价值，近年来有关的研究一直非常活跃。
目前人工核酸切割试剂的切割机理可以分为自由基机理磷酸醋水解机理和消去机理大类。
综述了这类切割试剂以及定点切割试剂的研究现状，并提出了今后研究的方向。
关键词人工核酸切割试剂定点切割试剂自由基机理磷酸醋水解机理消去机理引言近年来，人工核酸切割试剂的研究一直是生物化学和分子生物学中*为活跃的前沿领域之一所谓核酸切割，就是通过化学反应将长链的核酸分子断裂成较短的碎片。
研究人工核酸切割试剂的主要目的是合成核酸定点切割试剂。
它由两部分组成第部分叫做切割系统，为某种核酸切割试剂第部分叫做识别系统，由可以识别核酸底物的特定核昔酸序列的某种分子组成。
定点切割试剂可以在核酸底物的特定部位将其断裂，这与限制性内切酶对核酸的切割十分相似，因此定点切割试剂又被称为人工核酸酶。
研究人工核酸切割试剂具有非常重要的理论和应用价值。
首先，对人工核酸切割试剂的切割机理的研究将大大有助于我们对核酸酶催化机理的透彻了解。
一个突出的例子是等人川通过研究的模拟物对的切割机理，使人们对的酶催化机理有了更为深人的认识。
另一个例子是对金属离子催化核酸水解的机理的研究，可以有助于理解金属离子参与核酸酶催化核酸水解时所起的作用。
其次，定点切割试剂在疾病的基因治疗中有着十分重要的应用。
基因治疗的化学基础是反义技术即基因专一性地使表达有害蛋白的失活或者解体，从而抑制有害蛋白的合成而达到治疗疾病的目的。
具体的做法是采用与靶上某段序列互补的寡聚核昔酸作为识别系统，合成合适的定点切割试剂，然后将它作用于靶上使之被切断而失活。
第三，核酸切割试剂尤其是定点切割试剂可以作为重要的分子生物学工具。
众所周知，天然的核酸限制性内切酶所能识别的碱基序列非常短，只有或个碱基对。
因此，在较长的核酸链中，这样短的识别序列出现的频率会很高。
所以当一条较长的核酸链被限制性内切酶切断时，将产生非常多的碎片，这些碎片很难被进一步利用。
而定点切割试剂的识别系统可识别的核昔酸序列可以远远地大于个碱基对因而其专一性比限制性内切酶要高得多，所产生的切割碎片可以很少，进一步利用非常方便。
此外，将定点切割试剂用于反义技术还可以大大推进克隆技术的发展。
普通的核酸切割试剂在足迹技术中也得到了广泛的应用足迹技术中往往使用化学试剂或是核酸酶来水解与蛋白结合在一起的核酸。
大多数核酸酶由于体积太大而只具有有限的分辨率，因此需要更小的化学探针来获得更高的分辨率。
人工核酸切割试剂便可以充当这种化学探针。
同理，它也可以作为研究核酸高级结构的探针科考五叙第卷第期年月评述人工核酸切割试剂人厂下核酸切割试剂的切割机理主要分为自由基机理酉旨水解机理和消去机理大类，下面按照这种机理将众多的核酸切割试剂分别作一介绍。
按白由基机理氧化切割核酸的试剂按自由基机理切割核酸的试剂都能产生某种自由基进攻核酸的糖环或是碱基，夺去氢原子而导致其氧化破坏，进而使核酸链发生断裂由于产生的自由基的体积往往很小巨易于扩散，故而这类切割试剂常常可以用作性能良好的足迹试剂。
不过这类试剂也存在着较多的缺点切割产生的碎片的末端结构不同于酶解产生的末端结构，因此它们不能再用连接酶连接而很难被进一步利用由于这类试剂产生的自由基很容易扩散，会在多个位点造成切割，因此用这类试剂作切割系统的定点切割试剂的序列专一性会受到影响自由基对生物活体有毒副作用，因而无论是用于活体细胞内的研究还是作为药用都是不利的往往需要具有氧化还原活性的辅助因子，增加了体系的复杂性。
目前按照自由基机理切割核酸的研究主要集中在原因是远比容易发生水解反应，因此有关的切割大多都是按水解机理进行的……2.1一体系的络合物在双氧水存在下可以切割原因是该体系可以发生如下反应而生成经基自由基一这就是所谓的反应。
一被过氧化氢氧化，产生经基自由基，然后它进攻脱氧核糖环，将其上的氢原子脱去，再经过一系列后续反应而导致的断裂。
反应产物有‘一磷酸单醋和`一磷酸单酷。
脱氢的优先级大致为一经基自由基很容易扩散，所以它对的切割没有选择性此外，由于轻基自由基体积很小，故而它可以作为高分辨率的足迹试剂。
等人曾用一体系作为足迹试剂研究蛋白质的相互作用和核酸的高级结构。
一二氮杂菲铜体系一二氮杂菲可以与形成四面体的络合物。
该络合物可与的小沟结合，并在过氧化氢的存在下切割双链据推测反应中间体可能是经基自由基，而且非常可能是与铜络合的经基自由基十等自由基进攻链中脱氧核糖的一引发一系列的消除反应，造成链的断裂。
产物有自由碱基和等量的含有`一磷酸化和`一磷酸化末端的片断，以及脱氧核糖环被破坏的产物一甲叉一吠喃酮。
切割反应与底物的二级结构密切相关。
其中，型对阵十*为敏感，型是型反应性的一型是型反应性的以下。
对单链几乎没有作用可以切割但严格地切割单链区域，而不切割双链区一二氮杂非的八面体络合物钉锗铁锌和钻等金属可以与一二氮杂菲形成八面体络合物。
与四面体不同的是，它们主要作用于的大沟。
钉的一二氮杂菲络合物可以产生单线态氧，并进攻与络合物结合部位的邻近位评述第卷第期年月科考五叙点卜的碱基，从而使断裂。
对不同的碱基反应性次序为顺便提及，钉的其他一些络合物也可以通过自由基机理切割核酸，如其中代表三毗陡，代表二毗陡铭的一二氮杂菲络合物可以切割和反应是光依赖的氢原子夺去反应其进攻部位是核糖的一由于反应是直接作用于核糖的，因此没有碱基特异性。
还原剂体系可以切割但活性较弱，浓度需要达到级才有明显的切割效果不过当有某些还原性物质存在时其切割活性可以得到提高。
常用的还原剂是硫醇类化合物以及其他含琉基的化合物如半胧氨酸二硫苏糖醇还原型谷胧甘肤等这些化合物本身也可以切割但活性较弱。
当与共存时，总的切割活性会大大增加另外常用的一些还原剂还有氨基葡萄糖氨基蔗糖和维生素等。
切割机理是被还原成然后再经过一系列的反应生成轻基自由基或是其他的氧自由基，这些自由基再对产生切割作用外琳以及金属叶琳在无金属离子存在时，口卜琳可以作为光敏剂，在光照下生成单线态氧而进攻脱氧核糖环，从而导致断裂。
切割反应对核昔没有选择性具有氧化还原活性的金属离子，如了十等与叶琳络合形成金属叶琳，在有维生素过氧化物或亚碘酞苯存在时，可切割富含一的区域，而不切割富含一的区域。
其原因可能是叶琳与小沟结合，而鸟嘿吟上的一会抑制这一结光化学切割体系目前已经发现了许多具有光化学活性的物质在光照下可以切割如前面提到的锗的络合物叶琳以及金属叶琳，还有铀盐双核离子络合物富勒烯一氨基一苯并三嗓的一二氧化物和四苯基叶琳磷化合物等。
其中研究得较多的是铀盐体系。
铀盐切割无序列特异性，产物带有‘一磷酸或`一磷酸末端。
它可以作为足迹试剂研究蛋白质一核酸的相互作用。
铀盐切割的足迹图谱与一切割产生的图谱非常相似。
将乙酸铀用作光活性足迹试剂有其优点，即无需加人任何外源的激活因子即可启动对的切割。
等人发现光活化的乙酸铀也可切割并巨不具有一级和二级结构特异性。
所以乙酸铀还可以用于研究一蛋自质相互作用。
可以鳌合金属的三肤一在一的范围内能够与和以的定量关系形成络合物这个三肤一端的胺基两个肤键的酞胺氮原子和组氨酸咪哇基卜的亚胺基共提供个氮原子作为配体。
和证明这种络合物能产生活性氧自由基，从而可以切割年等人味lJ用组合化学中合成肤库的方法，研究了一品一和为某种氨基酸残基类型的各种只肤与十形成的络合物对的切割活性大小。
他们发现一的切割活性是*高的，比高出大约倍，并且所有的a一都选择性地切割双链中一碱基含量高的区域。
此外，与一和一形成的络合物可以选择性地切割的环结构一三肤也可与以的比例形成络合物并具有切割的活性。
等人将能与小沟结合的纺锤菌素及嵌合剂叮陡衍生物三者连接起来，在有和维生素存在时能切割并目一较科考五叙第卷第期年月评述与的结合常数要高由此可见三肤对一与结合的贡献。
锗的络合物与嵌合剂偶合后可与结合，在光的存在下夺去一而发生链的断裂。
这类光反应试剂包括和等如图所示一菲醒二亚胺其反应过程大致为络合物通过光诱导形成一个正离子自由基，然后它进攻一生成的产物为含`一和`一磷酸化末端的碎片以‘一磷酸甘油醛为末端的碎片自由碱基以及碱基丙烯酸。
氧也可能参与了反应，分子氧同脱氧核糖环上的`一自由基反应产生过氧化氢自由基，重排后氧插入糖环，再引起糖环断裂而使降解。
图和[十抗生素许多具有抗肿瘤功能的抗生素能够断裂双链并具有一定的区域选择性。
如博莱霉素它是一种糖肤抗菌素，对‘一一和’一一含量高的部位有特殊的亲和力。
与等离子结合后，由分子氧或等活化，在结合位点断裂切割产物包括自由碱基带`一和`一磷酸末端的碎片以及带‘一磷酸甘油醛末端的碎片。
博莱霉素也可以切割以及一杂交分子川。
烯二炔类抗生素也可以切割这些天然产物中含有能形成一个双自由基的烯二炔单元。
这一组化合物包括新制癌菌素和等。
烯二炔形成的双自由基能跨越的小沟并与之反应，使双链均断裂。
实验表明反应过程中试剂夺去底物一条链上的一或一互补链则发生不同的化学过程。
新制癌菌素对双链无切割活性，但对与的杂交分子有切割以醋水解机理切割核酸的试剂核酸中磷酸二醋键的水解也可以导致核酸断裂。
对于而言，往往是切割试剂促使`一脱质子化形成‘一一，然后它进攻连在`一位上的磷原子从而发生分子内转醋反应形成’一环磷酸醋，同时使得断裂。
对于而言，则往往是切割试剂直接提供某种亲核基团进攻磷原子，从而发生亲核取代反应而使水解。
水解类切割试剂相比于自由基类切割试剂而言具有许多优点生成的碎片具有`一或是‘一磷酸末端，且碱基和糖环不会被破坏，因此可以用连接酶连接起来而进一步加以利用这类试剂不产生易扩散的自由基，因此有利于合成高度序列专一性的定点切割试剂3）不需评述第卷第期年月科考遨众要氧化还原性的辅助因子，对生物体的毒害较小。
鉴于水解型切割试剂的上述优点，它可以作为定点切割试剂*佳的切割系统……2 2.
核酸酶模拟物设计核酸酶模拟物的基础是对天然核酸酶的结构与作用机理的了解。
酶模拟物的催化基团一般选择存在于天然酶活性位点处的催化基团或其他具有类似催化作用的基团。
和等人将这些催化基团共价连接在环糊精冠醚或其他一些电环化合物母体仁以模仿天然酶的空间结构。
由于的活性中心含有两个组氨酸残基，人们便用含有两个咪哇基团的化合物来模拟合成了含有两个咪哇基的一环糊精衍生物来催化环磷酸酷的水解，发现的确具有一定的活性，并目。
催化反应选择性地生成和痕量的如图其机理与的极为相似，也是一个咪哇基作为一般碱催化剂而另一个则以质子化的形式作为一般酸催化剂。
虽然这种酶模拟物的催化活性远低于但它很好地再现了其催化机理和效果。
一军一藻卜八罕一甲一罕一味一义甘币外一犷一一日丫。
甚，、日`一丫一C卜`飞图以环糊精作骨架的模拟物及其对环磷酸醋的水解将两个咪哩基共价连接到碱基嵌人剂卜可以使之与结合得更为牢固，从而可以提高切割活性。
和等人将两个甚至个咪哩基连接到叮陡环卜，得到的酶模拟物具有很好的切割的活性。
由于咪哇本身也可以切割因此只含有一个咪哩基的酶模拟物也受到了关注。
等人报道了一些只含有一个咪哩基的化合物可以切割tR为了模拟葡萄球菌核酸酶的作用机理，人们还合成了一些带有活性基团的化合物均具有不同程度催化或其模型化合物水解的活性。
目前核酸酶模拟物还存在许多缺陷，主要是切割效率低多以模型化合物为底物且反科考五叙第卷第期年月评述应在有机溶剂中进行。
所以酶模拟物实际上并不能完全模拟酶的作用。
金属离子及其络合物许多金属离子及其络合物都可以作为酸而催化核酸水解。
它们有个方面的催化作用一是它们可以与核酸卜的磷氧负电荷结合从而提高磷原子的亲电性，这有利于亲核试剂进攻形成五配位磷过渡态二是它们可与过渡态中带部分负电荷的离去基团结合，帮助其离去第三，与金属离子结合后，可以生成与其络合的氢氧根离子作为亲核试剂对于金属络合物而言，其配体的顺反结构对其是否具有切割活性有很大的影响。
在水溶液体系中，往有两个甚至更多的水分子可以与络合物中的金属离子结合。
当两个水分子处于顺式位置时这个络合物才可能具有切割活性比如在络合物C[.
十中代表各种胺类配体，如三乙二撑四胺两个乙二胺两个一丙二胺环状四乙二撑四胺等等只有当处于顺式位置时，与了结合的两个水分子才会也处于顺式位置，这时才可以催化核酸水解其机理如图所示。
尸一飞一二气了十了、图含两个顺式水分子的金属络合物催化核酸水解的机理可以促进水解的金属离子及其络合物很多如三价斓系金属离十）以及它们各自的络合物等。
和等人甘及道本身以及其与或是一四毗陡形成的络合物对以及寡聚有切割活性。
和等可以催化的某些模型化合物的水解却不能催化或是的水解和等则可与具有三级结构的tR在特定的位置相结合，使其在这些特殊位点发生水解对具有很高的切割活性。
等人在研究了对水解的催化活性后发现，所有斓系三价离子都有催化活性，而且活性随斓系离子原子序数的增加而增加，斓系的*后个离子和的催化活性*高。
对于在时可使的水解速度提高了倍即使是催化活性*低的在时，也可使的水解速度提高护倍十的许多络合物也可以切割如与一些六亚胺基大环化合物形成的络合物如图可以高效地催或是的水解。
金属离子及其络合物能否切割还取决于的结构。
例如，斓系离子络合物不能切割一杂合双链，目。
在有聚乙烯毗咯烷或乙烯二胺存在时，对一图的大环络合物评述第卷第期年月科带五叙双链的切割速度大大低于单链的切割速度能够以水解方式切割的体系还非常少，不多的几个例子都集中在钵离子上。
年川的研究小组发现能快速将切割为和无机磷。
等人则发现在特定的缓冲液中催化水解磷酸单醋的活性大于磷酸二醋，如水解的速度是倍与来苏糖核糖木糖戊醛糖和葡萄糖胺等糖类化合物可以在中性条件下络合形成均相溶液，该溶液对的水解也有显著的催化效果，如与葡萄糖胺的络合物可以使的水解速度提高倍之多除了以外，十与或的混合物也可以切割而单独的和均对无切割活性对的切割无碱基特异性，而且对单链和双链都有切割作用。
值得一提的是近年来有关双核金属离子络合物切割核酸的报道越来越多。
实际上，许多天然的磷酸酶就需要两个甚至多个金属离子活化才能发挥催化效果目前有关和三价斓系离子的双核络合物切割核酸的研究表明，双核金属离子络合物的催化活性比相应的单核络合物要高出许多，这是因为双核络合物中的两个金属离子可以产生协同效应，共同催化核酸底物的水解。
不同的金属离子在切割核酸中也具有协同效应。
等人发现可以与别的三价斓系离子共同作用于核酸底物而大大提高催化效率。
比如当十或是的摩尔比为时，水解切割的速度会有很大提高，而单独的rP，与均对无切割活四他们还发现与和以的摩尔比混合后的切割效率大大高于任何一个金属离子单独的催化活性与或也有协同效应二胺和多元胺在中性条件下，多元有机碱可以催化的分子内转醋反应而导致其水解，而一元胺则没有切割活性。
对于二元胺而言，它可以催化水解的条件是两个胺基的凡必须相差较大，以保证一个胺基质子化的同时另一个胺基非质子化。
非质子化的胺基可以作为碱帮助的`一轻基脱去质子而发生分子内转醋反应而正电性的质子化胺基可以稳定发生转醋反应时形成的带负电荷的五配位磷过渡态多元胺的催化机理与二元胺类似。
据报道乙二胺二乙撑三胺三乙撑四胺以及五乙撑六胺均对和有切割活性，但对却没有活性。
这与的高级结构有关。
一丙二胺对也有明显的切割活性乙二胺在众多多元胺中具有较高的活性，它的浓度为几时，在条件下经可将聚合度为的水解为小于五聚的碎片将具有切割活性的胺与的亲和物质相连后，可以使切割活性提高含有碱性氨基酸残基的多肤许多含精氨酸或赖氨酸的多肤可以催化的水解一y一）以及的一与的一的共聚物均对寡聚有切割作用。
其中一*为有效，在赖氨酸残基浓度为几时可使的水解速度提高多肤的二级结构对是否具有切割活性有着重要的影响，一折叠或一螺旋结构对切割是必须的。
不能切割原因是其侧链咪哩基的碱性不够强，而目其二级结构也不合适。
经过模型研究发现，带正电荷的碱性氨基酸残基排列成线性时可对水解起催化效应，而亮科考五叙第卷第期。
年月评述氨酸这样的脂肪族氨基酸残基的存在可以使多肤链具有合适的二级结构丝组二肤体系赵玉芬的研究小组发现，丝组二肤可以在中性条件下通过水解方式切割线型和超螺旋型的这是迄今为止的第例不含金属离子的水解型切割试剂，也是第例能够以水解方式切割的小肤。
丝组二肤所含的一端胺基轻基和咪哇基为切割的必需基团。
尽管目前切割机理尚不十分清楚，但可以合理地推测羚基起到了亲核进攻磷原子的作用，而正电性的质子化胺基很可能可以稳定带负电核的五配位磷过渡态。
咪哩基的作用还难以推断。
非常有趣的是，与丝组二肤十分相似的组丝二肤对没有切割活性。
可见卜述个必需基团的相互位置对是否具有切割活性也是至关重要的……2 3以消除机理切割核酸的试剂年，和的实验室同时分别发现了赖色赖三肤不仅可以识别中的脱碱基部位，并且可以在该部位产生切口。
其原因可能是由于色氨酸残基因与核酸之间的碱基堆积作用而占据了脱碱基部位附近的位置，从而使赖氨酸残基接近脱碱基部位，而脱碱基的核糖存在半缩醛和开环的醛的互变异构，因而该位点非常容易被切断。
这类试剂相当少，不具有普遍性。
定点切割试剂上述各类切割试剂连上识别系统即构成定点切割试剂。
目前已经发展了多种识别系统，包括寡聚核昔酸结合蛋白能够与小沟结合的物质如偏端霉素碱基扦插试剂如叮陡等。
后两种识别系统由于和核酸底物结合的特异性不高而很少使用。
*常使用的识别系统是寡聚核昔酸，尤其是寡聚这里举几个例子。
等人曾将两段寡聚连接到一个碳原子卜，然后将切割试剂乙二撑二胺也连接到同一个碳上，从而得到了一个定点切割试剂类似的，他们又将乙二胺与一个十九聚的的‘一端相连，可序列选择性地切割一个三十聚的等人则将一种含有两个咪哇基的化合物连接到寡聚的’一端或是`一端，所得的试剂可以进行定点切割。
除了使用寡聚以外，也可以使用寡聚作为识别系统。
等人的研究小组将与一段相连后用于切割单链或是双链的链段分别与单链或是双链形成杂交双链或是三链从而发挥识别作用，得到了较好的序列特异性的切割结果。
结合蛋白也是较为常用的识别系统。
比如大肠杆菌中含有一种基因激活蛋白，它能与发生特异性的结合。
等人利用其卜的一个半胧氨酸残基与C[偶合后可以定点切割等人以及的研究小组则分别将甘甘组三肤与iN或的络合物共价连接到一个具有锌指结构的结合蛋白或是重组酶的一端，得到的试剂对的切割也具有序列特异性。
近来又发展了两类新的识别系统，一类是多肚核酸另一类是多聚酸胺。
是一种类似物，它以肤键骨架取代了中的脱氧核糖磷酸骨架如图可以与互补的或形成类似双螺旋的结构，并遵守W一碱基配对原则还可与双链结合形成三链。
与互补的核酸链结合具有亲和性高特异性强及稳定性好等特点。
评述第卷第期年月科考五叙几人飞全一卜I图与的结构比较近些年来文献中已报道了一些定点切割试剂采用作为识别系统。
比如等人曾将次氨基三乙酸记共价连接到一段仁。
次胺基三乙酸与在结构上较为相似，它与形成的络合物在存在下也可以通过自由基机理切割连接后所得的定点切割试剂可以和双链的底物形成三螺旋而产生识别作用，具有较好的序列特异性切割效果。
年等人将两段10个碱基长度的通过一条脂肪链相连，然后在其中某一段的末端连仁一所得的试剂可以嵌人到双链底物中，与其中的一条链相结合而形成三螺旋结构。
当体系中有时，一便可以序列特异性地切割双链等人则将叶啦和的络合物连接到一段用以切割一段长个碱基对的双链同样得到了序列特异性的切割结果。
多聚酞胺含有多个一甲基毗咯一甲基一轻基毗咯一甲基咪哇单元和一个，一氨基丁酸如图它通过与小沟结合而发挥识别作用。，一氨基丁酸的引入可以使它形成头针状的反平行结构，并民可以增大多聚酸胺与的亲和性，提高碱基识别效率。
图多聚酞胺的结构科考五叙第卷第期年月评述美国加州理工大学的教授年提出了多聚酞胺识别碱基对的规则反平行成对的识别一碱基对，反则识别一碱基对反平行成对的识别一碱基对，反之则识别一碱基对图由于多聚酞胺*近才发展起来，将其用于定点切割的报道还很少。
气、币孙一吓刃丫添石补吓乃丫舀奋。
杯夕入一只卜IP巴图多聚酞胺对双链的识别作用示意图展望在大类人工核酸切割试剂中，自由基型的*多，水解型的则相对较少，尤其是切割的则更少。
鉴于水解型切割试剂比自由基型的具有许多优点，故此它是合成定点切割试剂的*佳切割系统。
但目前这类试剂中活性高的还不多，还远远不能与核酸酶的活性相媲美，因此发展高活性的水解型切割试剂尤其是的水解切割试剂将是今后研究的重点。
目前在研究水解型切割试剂时，往往使用核酸的模型化合物作为底物，如对硝基苯酚的磷酸二醋等。
这类活化的磷酸酷化合物的醋基都是很好的离去基团，比核酸更容易水解。
之所以使用这类化合物，是因为切割试剂的活性往往太低，不足以使核酸发生明显的断裂，同时也是为了使反应体系较为简单且易于检测。
但模型化合物毕竟不是真正的核酸，故而人们一直在试图尽量直接使用核酸作为底物。
现在已经合成出了各种各样的定点切割试剂，但所有的定点切割反应都是在生物体外进行的。
为了使定点切割试剂在分子生物学上发挥其巨大的应用潜力，比如将生物活体内的一段癌基因切除，就必须将它导人生物活体中去切割靶分子。
因此，将定点切割试剂导人活体细胞内进行切割反应将是本领域研究的目标。
这要求切割系统和识别系统都具有良好的透膜性，并且要能够耐受细胞中的各种酶的降解破坏作用。
是一种很有前途的识别系统，它既不被核酸酶水解，也不被蛋白酶水解，因而具有相当好的稳定性。
的缺点是其极性较强，因而透过细胞膜的能力较差不过这一缺陷可以通过对进行化学修饰而得以改善。
虽然目前尚不能在生物活体内进行定点切割反应，但人们已经在尝试一种过渡性的实验方法，即将定点切割试剂和底物放在含有各种酶的细胞溶解产物中进行反应，相信这一方法将会较大地推进本领域的研究工作。
参考文献一a一一e一一t一s t一写一一1一评述第卷第期年月科考立粗一a一汉一入一了订一t一一一2一印一川卜川一卜码一印一]一一科考五叙第卷第期年月评述2吕一一n一甲e一一凡一从e玄一一n一一n一少E一刀m泊一‘一一一一一一y一4一一’一一比n尹一一t一一一i一d一科一丘一一们评述第卷第期年月科考氏叙e一刀一a一们a `一一礴一印之一一n一刁一赵王芬，李向红，麻远，等。
丝氨酞组氨酸磷酞化丝氨酸磷酞化苏氨酸用作核酸切割试剂。
中国专利号。
一之飞1一a一一砚工一一l t一毛In一之L一u一e一一科考连叙第卷第期年月评述只一一1一L一一汉一L一一是一n一收修改稿根癌农杆菌介导遗传转化研究的若干新进展李卫郭光沁郑国锡兰州大学细胞生物学研究所，兰州联系人。
i一刃一综述了根癌农杆菌介导的遗传转化近几年获得的新进展。
在转化机理方面，对农杆菌自身转录与调控的研究已相当深入，而对有关的植物编码因子的研究也已取得了实质性进展在转化范围上，对真菌与裸子植物的转化取得了不少进展，单子叶植物尤其是一些有重要经济价值的禾谷类作物应用农杆菌介导相继获得了转化植株在转化方法方面，发展了新的简单有效的整体植株感染法，并将一转移和整合原理结合到基因枪等直接转移方法上细菌人工染色体与农杆菌的联合应用赋予了其大片段转化的功能。
针对上述领域，指出了其中仍然存在的一些问题并提出了一些构想。
根癌农杆菌遗传转化真菌单子叶植物大片段在植物基因工程的发展中，研究*清楚和应用*成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化，在已获得的近种转基因植物中约80是由该菌介导完成的起初，人们认为农杆菌仅能转化双子叶植物裸子植物以及少数几种单子叶植物而近几年，由于在一些重要的单子叶植物以及在真菌中应用农杆菌转化获得了成功该方法以转基因低拷贝遗传稳定以及能够转化大片段等优点又受到了人们极大的关注。
本文对农杆菌介导遗传转化的机理方法范围以及策略等方面的新进展和动向做一评述，并提出有价值的研究方向。
农杆菌介导的遗传转化机理农杆菌转化的详细机理已有大量综述一这里不拟详述，只给出其大略过程见图并
